植物科学新技术 植物透明化试剂                                                                     

ClearSee™

ClearSee^™ 是一种仅需固定、洗净、透明化三步简单操作即可实现植物组织透明化的试剂。作为植物科学的研究工具，期待可以阐明细胞水平的现象和整个个体之间的系统联系。

HP数据：由名古屋大学大学院理学研究科 栗原大辅特任助教、水多阳子研究员提供

◆操作步骤

使用 ClearSee^™ 的透明化方法，只需1）固定、2）洗净、3）透明化三个步骤。详细方法可参考随产品附赠的使用说明书。

以下，是拟南芥叶和幼株的使用案例。

1.　固定

①　使用4%甲醛溶液固定样本^*1。

②　将样本放入干燥机中，用真空泵减压，在室温下静置30分钟，并固定。

②　以上操作重复两次。

②　为了防止植物样品在减压过程中飞出，建议打开管盖，用封口膜密封，并用针在上面扎孔^*2,3。

2.　洗净

去除固定液，加入1 mL的1×PBS缓冲液，静置1分钟。然后去除1×PBS缓冲液，重新加入1 mL的1×PBS缓冲液，静置1分钟。

以上操作重复两次。

3.　透明化处理

去除1×PBS缓冲液，添加1.3 mL的ClearSee^™。

打开管盖后用封口膜密封，并用针在上面扎孔。放入干燥机中，用真空泵减压，并在室温下静置1小时。

取下封口膜，盖好管盖。避光，室温静置，透明化^*4。

如有需要可更换新的ClearSee^™。

4.　透明化过程

图4. ClearSee™中的拟南芥叶和幼株

图5. 可以观察到样本周围叶绿素（1-2天后）

图6. 更换新的 ClearSee™ 后的样本

图7. 透明化的拟南芥叶和动株（3-5天后）

使用ClearSee^™ 进行透明化需要的物品

注意

※　由于植物活体样本含有空气，添加溶液时植物就会漂浮起来。请尽可能地将植物样本浸入固定液中。

※　请将干燥机设定在-90 kPa左右。根据植物样本的不同，有时减压会过强。减压过强的话，会破坏植物组织和细胞。开始减压后，由于会抽出植

※　物样本中的空气，会产生气泡。为了让气泡消失，请缓慢调整减压的压强。

※　从减压状态恢复至大气压强时，请缓慢进行。如果急速恢复至大气压强的话，会破坏植物组织和细胞。

※　透明化的时间根据植物种类和组织而异，请参照以下的时间。

※　根：1~2天、叶和幼株：4~7天、雌蕊：2周、成熟组织：4周。

◆观察案例

5.　观察

在载玻片上用凡士林或油脂制作一个围栏，放入适量 ClearSee^™，用镊子将样本移入，盖好盖玻片，并用荧光显微镜观察。由于 ClearSee^™干燥后会产生沉淀，所以用凡士林或油脂来防止其干燥。观察结束后，可以将植物样本放回装有 ClearSee^™ 的微管中进行保存。

另外，用 ClearSee^™ 透明化的样本亦可用荧光色素进行染色。细胞核染色时，向 ClearSee^™ 中添加终浓度为 10 μg/ mL 的双苯甲酰亚胺 H33258 三盐酸盐，双苯甲亚胺 H33342 或 DAPI，细胞壁染色时，使用终浓度为 1 mg/mL，静置１小时后，更换新的 ClearSee^™ ，再静置１小时后，在荧光显微镜下进行观察。

图8. 经透明化处理的拟南芥叶在明场中呈透明状态，叶绿素的红色自发荧光消失。

图8. 　由于可以对整片叶进行观察，因此也可以观察到维管束内的荧光蛋白。比例尺为 200 μm。

图9. 使用 ClearSee^™ 透明化的完整的雌蕊的荧光观察。

图2.　用４个颜色（蓝色，绿色，黄色，红色）的荧光蛋白标记花粉管。

图2.　根据参考文献改编转载。

图10. 使用 ClearSee^™ 处理４天的拟南芥的根。

图10.　生长素应答细胞的细胞核用绿色、全身的细胞核用紫色显示。

图10.　根据参考文献改编转载。

■其他植物的透明化案例

使用 ClearSee^™ 透明化６天后的蓝猪耳、矮牵牛、烟草、番茄、黄瓜、稻叶。

稻叶在透明化时，由于叶子的表面有蜡层，因此很难将溶液渗入组织里，通过在氯仿等有机溶剂中浸泡 10~30 秒除蜡后，开始固定的步骤。

图11. 使用 ClearSee^™ 透明化的各种植物叶片（６天后）

◆参考文献

Kurihara, D. et al.: Development, 142, 4168-4179 （2015）.

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